泛素蛋白催化的一系列反应的发生，整个过程被称为泛素化信号通路。在第一步反应中，泛素活化酶(又被称为E1)水解ATP并将一个泛素分子腺苷酸化。接着，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。被腺苷酸化的泛素分子接着被转移到第二个酶，泛素交联酶(E2)的半胱氨酸残基上。
靶蛋白在被蛋白酶体识别之前，必须被标记上至少四个泛素单体分子(以多泛素链的形式)。因此，是E3使得这一系统具有了底物特异性。 E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细胞类型，人体中就存在大量不同的E3蛋白，这说明泛素-蛋白酶体系统可以作用于数量巨大的靶蛋白。