历史可追溯到创建于1641年的“保全宫”。1662年，郑氏王朝期间重建，后改称“鹿耳门妈祖庙”。道光十一年（1831年）因曾文溪泛滥，下游支流改道而造成庙宇毁损，因此当地民众将神尊寄奉于三郊镇港海安宫。同治十三年（1874年），庙宇遭洪水沖毁。大正三年（1914年），当地民发起重建庙宇，大正五年（1916年）安座，大正七年（1918年）落成。

据传圣母庙在明朝崇祯十四年（西元1641年）时，即由栖居于鹿耳门的渔民搭建简陋的草庙，前殿奉祀水仙尊王，后殿供奉佛祖，中殿则主祀与真人同高的天上圣母软身神尊，当地称为「鹿耳门妈」，即圣母庙的前身。

正统鹿耳门圣母庙整体建筑是由高忠信先生以是仿照北京紫禁城宫殿建筑所构思设计的，分为南北四进三落五殿，两侧则以厢房迴廊相接，加上庙宇四周的壕沟，使圣母庙更像中国古代宫殿格局。而第一进为单檐歇山建筑的「五王殿」，奉祀李、池、吴、范、朱五府千岁，以及水仙尊王及中坛元帅等神尊；第二进为主殿「妈祖殿」，为重檐歇山的建筑风格，奉祀天上圣母、注生娘娘、福德正神、财神爷；而第三进「佛祖殿」，分别供奉释迦佛祖、文殊菩萨、普贤萨，以及千手千眼观世音、南海观世音、西天佛祖、金面佛祖等等神像，而佛祖殿三楼为第四进「天公殿」供奉祀玉皇上帝、三官大帝、三恩主、南斗星君、北斗星君、张天师、普化天尊、王天君、斗姥元君、南极仙翁、月下老人、六十星宿神等众神明。而每逢丑、辰、未、戍年农曆三月，三年一科的「鹿耳门妈香，五府千岁醮」，是谓「土城仔香醮」，是正统鹿耳门圣母庙最隆重盛大的祭祀与酬神节日。